空間轉(zhuǎn)錄組樣本制備要求

1、前言

1.1 適用范圍

本指南介紹百邁客實(shí)驗(yàn)平臺(tái)空間轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。

1.2 聲明

我國(guó)法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風(fēng)疹、麻風(fēng)病、急性出血性結(jié)膜炎、黑熱病、絲蟲病、包蟲病、還有除了霍亂、細(xì)菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

涉及上述傳染病的科學(xué)研究需符合國(guó)家的相關(guān)規(guī)定，為嚴(yán)格遵守國(guó)家法律法規(guī)，本著對(duì)社會(huì)及相關(guān)操作人員負(fù)責(zé)的態(tài)度，我司要求客戶方真實(shí)準(zhǔn)確地提供樣品的生物安全性信息，對(duì)樣品是否含有上述感染性病原體進(jìn)行事先說(shuō)明。樣品中含有上述感染性病原體時(shí)，客戶方需要提供符合生物安全等級(jí)要求的實(shí)驗(yàn)室以便開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，客戶方有義務(wù)協(xié)助我方實(shí)驗(yàn)員做好實(shí)驗(yàn)安全防護(hù)?？蛻舴讲坏秒[瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)我司將停止進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目，已產(chǎn)生的費(fèi)用由客戶方承擔(dān)。如因客戶方提供的生物安全性信息不實(shí)、隱瞞樣品感染性等有關(guān)情況等造成實(shí)驗(yàn)員及相關(guān)人員被感染、疾病傳播等嚴(yán)重后果的，我司將按規(guī)定報(bào)告國(guó)家相關(guān)部門，并將通過(guò)法律等手段追究相關(guān)責(zé)任。

2、項(xiàng)目流程

目前百邁客空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)模式默認(rèn)為組織寄送模式，如果有特殊情況需要上門服務(wù)，請(qǐng)與百邁客技術(shù)人員確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備情況。

組織寄送前請(qǐng)至少提前1周進(jìn)行預(yù)約，百邁客接收到樣本并確認(rèn)樣本無(wú)異常后，3-5天內(nèi)安排RNA質(zhì)檢并反饋質(zhì)檢結(jié)果，質(zhì)檢合格后安排切片、組織結(jié)構(gòu)確認(rèn)與透化。

3、新鮮冷凍樣本

3.1 樣本要求

10x空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長(zhǎng)寬不宜超過(guò)6.5*6.5mm，百創(chuàng)S3000空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長(zhǎng)寬不宜超過(guò)6.8*6.8mm，厚度＞1.5mm，S2000A空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長(zhǎng)寬不宜超過(guò)11*11mm，組織截面覆蓋小于25%的組織，建議多個(gè)包埋成一個(gè)OCT包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個(gè)組織保持在一個(gè)水平面充分利用捕獲區(qū)域。

注1：在樣本量足夠的情況下，每個(gè)動(dòng)物樣本最好準(zhǔn)備至少2個(gè)包埋塊，1份用于RNA質(zhì)檢（切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見第3部分）、切片選片、上透化芯片和表達(dá)芯片，另1份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項(xiàng)目周期。

注2：在樣本量足夠的情況下，每個(gè)植物樣本最好準(zhǔn)備至少3個(gè)包埋塊，因植物組織目的結(jié)構(gòu)較薄，實(shí)驗(yàn)建議進(jìn)行全流程方案進(jìn)行空間實(shí)驗(yàn)，即一個(gè)包埋塊在一次切片實(shí)驗(yàn)中完成結(jié)構(gòu)確認(rèn)，貼片表達(dá)，貼片透化，避免反復(fù)切片導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損失，其余2塊用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項(xiàng)目周期。

3.2 樣本采集與運(yùn)輸

3.2.1 采集前準(zhǔn)備

1. 所有器械和環(huán)境需要消毒滅菌，所有器械（如剪刀、鑷子等）需要冰上預(yù)冷；
2. 在醫(yī)用托盤上放一層冰，然后覆蓋上一層錫箔紙，再鋪幾層無(wú)菌布，將個(gè)體放在無(wú)菌布上進(jìn)行取樣，保持整個(gè)取樣過(guò)程在低溫中進(jìn)行，可以延緩核酸的降解，（動(dòng)物組織建議針對(duì)活體或剛死亡個(gè)體進(jìn)行解剖取樣）；
3. 動(dòng)物組織如果取樣后無(wú)法立即進(jìn)行后續(xù)包埋實(shí)驗(yàn)，可以將樣本清理干凈后，暫時(shí)放入組織保護(hù)液（美天旎，貨號(hào)130-100-008）或DPBS或生理鹽水中并置于4℃冰箱暫存，暫存時(shí)間最長(zhǎng)不要超過(guò)5h，以免造成RNA降解，RIN值質(zhì)檢不合格；
4. 使用指定品牌的OCT（櫻花牌-4583）或OCT（leica-FSC 22）進(jìn)行包埋，OCT使用前在冰上預(yù)冷30分鐘。

3.2.2 動(dòng)物樣本采集

1. 取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）；
2. 迅速用預(yù)冷的 PBS溶液（RNase?free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈，然后用無(wú)菌紗布吸凈表面液體；
3. 如果組織體積較大，需要將組織切成長(zhǎng)寬＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊，用7*7*5mm的特小號(hào)包埋盒進(jìn)行包埋；取下的組織應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)包埋實(shí)驗(yàn)。

注：原則上實(shí)驗(yàn)室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶網(wǎng)上自行購(gòu)買，如有需要請(qǐng)聯(lián)系運(yùn)營(yíng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室是否有存貨，因 OCT 試劑無(wú)法分裝運(yùn)送，實(shí)驗(yàn)室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.3?植物樣本采集

1. 培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本：在無(wú)菌超凈臺(tái)中取出組織，去除組織表面附著的培養(yǎng)基，用超純水將組織表面清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預(yù)冷的鑷子和剪刀將目標(biāo)區(qū)域外的組織結(jié)構(gòu)盡量去除，若組織內(nèi)部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
2. 土壤培養(yǎng)樣本：將組織從培養(yǎng)土中完整取出，去除土壤及雜質(zhì)，用超純水將組織表面土壤及雜質(zhì)徹底清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預(yù)冷的鑷子和剪刀將目標(biāo)區(qū)域外的組織結(jié)構(gòu)盡量去除，若組織內(nèi)部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
3. 將目標(biāo)組織按照不同組織類型包埋方法進(jìn)行包埋

注：原則上實(shí)驗(yàn)室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶網(wǎng)上自行購(gòu)買，如有需要請(qǐng)聯(lián)系運(yùn)營(yíng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室是否有存貨，因 OCT 試劑無(wú)法分裝運(yùn)送，實(shí)驗(yàn)室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.4?動(dòng)物組織速凍包埋

下文提供了2種包埋方法：干冰包埋法、異戊烷+液氮包埋法，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇。干冰包埋法適合更多的組織類型，是最常用的包埋方法，也可以得到較好的切片結(jié)果；異戊烷+液氮包埋法，可以快速降溫，保護(hù)細(xì)胞完整性，但操作較復(fù)雜，而且異戊烷對(duì)人體有一定的健康危害，一些較小、較輕的樣本如穿刺樣本推薦使用液氮+異戊烷的方法進(jìn)行冷凍包埋。

方法1干冰包埋法（常用）

無(wú)需異戊烷，直接用干冰粒進(jìn)行包埋。

1. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
2. 標(biāo)記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對(duì)包埋盒做標(biāo)記，一旦冷凍包埋盒將很難標(biāo)記信息）；
3. 將包埋盒轉(zhuǎn)移到冰上，在包埋盒中注入預(yù)冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
4. 冰上預(yù)冷鑷子，將組織放入OCT中，調(diào)整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒(méi)有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除，以免影響組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會(huì)變白，將很難確定組織的方向）；
5. 將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會(huì)影響組織的方向，同時(shí)能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達(dá)到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結(jié)變白（如下圖，右）。
6. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運(yùn)輸。

方法2?異戊烷+液氮包埋法

腦組織等容易形成冰晶或者水腫病變組織推薦使用此方案進(jìn)行包埋。

1. 用異戊烷（足以完全浸沒(méi)組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育15分鐘；
2. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
3. 標(biāo)記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對(duì)包埋盒做標(biāo)記，一旦冷凍包埋盒將很難標(biāo)記信息）；
4. 將包埋盒轉(zhuǎn)移到冰上，在包埋盒中注入預(yù)冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
5. 冰上預(yù)冷鑷子，將組織放入OCT中，調(diào)整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒(méi)有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除。以免影響組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會(huì)變白，將很難確定組織的方向）；
6. 用鑷子將包埋盒放到異戊烷上，不要使異戊烷浸入包埋盒內(nèi)，直到組織凍結(jié)，冷凍時(shí)間可根據(jù)組織類型和大小而變化（如下圖）；
7. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰運(yùn)輸。

3.2.5 植物組織速凍包埋

下文提供了 3 種包埋方法，根據(jù)植物組織的部位不同，我們推薦了不同的包埋方式：

方法一?：抽真空+干冰冷凍OCT包埋（不需要固定）

1）按照2.3植物采樣方法裁取樣本，空隙較多組織（花苞、莖尖）需將組織部分切開，目標(biāo)區(qū)域外組織需盡可能全部去除。

2）將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。

3）冰上預(yù)冷75% OCT包埋劑溶液（5mlOCT+2.5ml滅菌水顛倒混勻），1.5ml離心管中加入1ml 75%OCT，將植物組織浸潤(rùn)在其中，將平底的無(wú)吸附膜的吸附柱放入1.5ml離心管中，以防止抽真空過(guò)程組織上浮在OCT表面，打開所有管蓋，置于真空濃縮儀中（注意配平）。室溫抽真空10min，摸索設(shè)置成V-AQ，促進(jìn)OCT溶液充分包裹和進(jìn)入組織空隙中，保證OCT填充包埋組織的完整性。如下圖：

4）將包埋盒放置在冰上 ，標(biāo)記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

5）在冰上用鑷子輕輕夾住組織，輕輕擦拭表面的OCT，緩慢放入預(yù)冷的含OCT的包埋盒中 ，加預(yù)冷的OCT直至完全包裹組織，并調(diào)整組織在OCT中的位置 ，保證目標(biāo)平面與切面水平一致，如果多個(gè)組織包埋在一起時(shí)一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起，此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。

6）將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會(huì)影響組織的方向，同時(shí)能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達(dá)到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結(jié)變白（如下圖，右）。

7）將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運(yùn)輸。

方法二?：直接冷凍OCT包埋（無(wú)需抽真空）

1. 按照2.3植物采樣方法裁取樣本
2. 將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。
3. 將包埋盒放置在冰上 ，標(biāo)記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。
4. 在冰上用鑷子輕輕夾住組織 ，緩慢放入預(yù)冷的OCT包埋劑中 ，直至OCT完全包裹組織。
5. 調(diào)整組織在OCT中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標(biāo)平面與切面水平一致。如果多個(gè)組織包埋在一起時(shí)一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。
6. 用異戊烷（足以完全浸沒(méi)組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育5- 10分鐘，時(shí)間不宜太久，防止異戊烷凝結(jié) 。（若無(wú)異戊烷及液氮可使用干冰包埋）
7. 用鑷子夾住包埋盒置于預(yù)冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒(méi)）或干冰上，然后等待OCT凝固變白。
8. 將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標(biāo)記，利用干冰運(yùn)輸。

方法三?：石蠟包埋

石蠟包埋請(qǐng)使用百邁客專用試劑盒(試用裝)，此試劑盒適用于主根、莖、幼果（含水量大）等組織類型，OCT切片破碎的組織也可以使用此試劑盒嘗試包埋切片。

詳細(xì)操作步驟請(qǐng)查看試劑盒說(shuō)明書（此試劑盒目前為試用裝，未正式發(fā)布，有需求可溝通銷售）

3.2.6?樣本寄送運(yùn)輸

包埋后的組織用錫箔紙包住，放入密封袋中密封，放入樣本盒在液氮或者-80℃冰箱長(zhǎng)期保存，或者放置在干冰上進(jìn)行冷凍運(yùn)輸，寄送到百邁客實(shí)驗(yàn)室，干冰寄送推薦用量約5kg/日。

不規(guī)范送樣示例：

A.包埋時(shí)組織放置靠近最下層，組織未被OCT包裹，導(dǎo)致樣本RNA降解，質(zhì)檢不合格；

B.組織暴露在空氣中，導(dǎo)致樣本降解，組織兩側(cè)無(wú)OCT支撐，展片時(shí)可能會(huì)破壞樣本結(jié)構(gòu)；

C.組織較小，不滿足做表達(dá)最小25%的要求；

D.同一個(gè)包埋塊包埋了多個(gè)樣本，但不在同一個(gè)平面，并且每一個(gè)樣本組織過(guò)小，覆蓋區(qū)域有限，可能導(dǎo)致分析有效數(shù)據(jù)偏低。

3.3?切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

• 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)：對(duì)動(dòng)物組織切片進(jìn)行H&E染色，對(duì)植物組織切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，觀察是否獲取到目標(biāo)區(qū)域，組織形態(tài)完整性是否在可接受范圍內(nèi)（例如是否有大的裂痕，存在明顯的空泡、褶皺等）。
• RNA完整性檢測(cè)：收取10-15張切片，利用Agilent2100對(duì)樣本進(jìn)行RNA完整性檢測(cè)，要求RNARIN≥6，則認(rèn)為樣本完整性滿足實(shí)驗(yàn)要求，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。具體切片質(zhì)檢量如下：

1）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的1/5-1/4，質(zhì)檢量要求~20張（左圖）；

2）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的＞1/3，質(zhì)檢量要求~15張（右圖）。

3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)量推薦

測(cè)序數(shù)據(jù)量：10x Genomics推薦60G/樣，百創(chuàng)S3000推薦250G/樣；

測(cè)序平臺(tái)：SURFSeq?5000