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發(fā)布于 2021年9月3日

2021年8月，國內第一篇基于10x Genomics單細胞聯合10× Visium 空間轉錄組的文章在《Cell Research》見刊！文章作者來自中國科學院動物研究所的劉峰老師課題組和北京大學生命科學學院的李程老師課題組，利用scRNA-seq和ST技術構建小鼠胎肝（FL）的時空轉錄組圖譜，揭示HSCs/MPPs的轉錄異質性，進一步解析造血干細胞和多能祖細胞（HSC/MPP）在其固有生態(tài)位擴增的細胞和分子機制。

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實驗材料

將雄性CD45.1小鼠與雌性CD45.2小鼠雜交獲得小鼠胚胎；終止妊娠后獲得的人類胚胎；健康志愿者處收集人類臍帶血 (CB) 樣本

ScRNA-seq樣本：經FACS分選FL四個時間點（E11.5，E12.5，E13.5，和 E14.5）的細胞，包括造血細胞（HC）、內皮細胞（EC）和非造血/費內皮細胞（NC），之后混合測序。

ST樣本：使用來自 E14.5 胚胎沿背腹軸的四個切片進行了 10× Visium ST，重點放在 FL 區(qū)域。

實驗方法

免疫熒光，菌落形成單位(CFU)培養(yǎng)試驗，移植試驗，蛋白免疫印跡（WB），scRNA-seq，10× Visium ST，小鼠和人之間FL的跨物種分析

文章思路圖

研究背景

在哺乳動物中，造血干細胞和多能祖細胞 (HSCs/MPPs) 占據造血系統層次結構的頂端，表現出多向分化和自我更新的能力。HSC/MPP 擴增的研究為再生醫(yī)學帶來了巨大希望，并且科學家們已經做出了重大努力，通過基因工程或優(yōu)化培養(yǎng)條件來實現長期的HSC/MPP離體擴增。然而，在目前的HSC/MPP離體擴增培養(yǎng)中，挑戰(zhàn)的關鍵是如何保持干細胞的特性；因此，需要全面了解 HSC/MPP 在體內固有生態(tài)位中的擴增。高度血管化的胎肝 (FL) 是各種來源的造血細胞 (HC)的臨時發(fā)育部位。研究證明在小鼠中，FL結構生態(tài)位細胞包括內皮細胞（EC）、基質細胞和成肝細胞，并通過多樣化的生長因子、細胞因子和趨化因子與HSC/MPP相互作用。HSC/MPP 和不同生態(tài)位細胞之間復雜的相互作用的潛在機制，以及 HSC/MPP 擴增的系統性調控網絡仍然難以捉摸。

結果討論

一、發(fā)育中小鼠 FL 的單細胞轉錄組圖譜

基于10× Genomics，構建E11.5，E12.5，E13.5和 E14.5 FL 的單細胞分辨率細胞圖譜，共計包含有32449個單細胞，分為了21個細胞簇，包括 18 個 HC 簇和 3 個結構生態(tài)位細胞簇，并發(fā)現它們的比例與發(fā)育階段動態(tài)相關。四個時間點的差異基因的GO 分析顯示有絲分裂細胞周期調節(jié)和細胞生長也富含不同類型的結構生態(tài)位細胞，表明細胞數量和大小的整體增加用以適應 FL 擴張。

圖1 發(fā)育中小鼠 FL 的單細胞轉錄組圖譜

a FL組織的scRNA-seq 實驗流程示意圖。b FL中所有單細胞的UMAP可視化。c熱圖顯示每個細胞簇前20個DEGs的表達模式。d在 FL 發(fā)育過程中，HSC/MPP 中富集的 GO通路。e FL發(fā)育過程中 HSC/MPP 中富集的 DEGs的散點圖。

二、富含 CD93 的 HSCs/MPPs 表現出增強的干細胞特性

GO 和 DEG 分析表明 HSC/MPP1-3 中造血調節(jié)和分化、主動翻譯過程和細胞周期調節(jié)等通路富集。HSC/MPP亞群和下游髓系淋巴祖細胞之間的軌跡分析顯示 HSC/MPP1 占據造血系統層級的頂部?？傮w而言，這些結果表明，與 HSC/MPP2-3 相比，HSC/MPP1 表現出最強大的干細胞轉錄組特征。

圖2 富含CD93 的 HSC/MPP 表現出增強的干細胞特性

a HSC/MPP三個亞群的GO富集分析。b三種HSC/MPP亞型中富集的DEG的散點圖。c HSC/MPP1與HSC/MPP2（左）與 HSC/MPP3（右）中所有基因表達的散點圖。d箱線圖顯示了三種 HSC/MPP 亞型的 hscScore 分布。e軌跡分析重建HSC/MPP 到淋巴和骨髓祖細胞的譜系分化。f熱圖顯示了三種 HSC/MPP 亞型中HSC/MPP 特征基因和Cd93的表達模式。g使用 CD93 + SLAM-LSK (CD93 + HSC) 和 CD93 – HSC進行初次移植后 8 周受者外周血 (PB) 中供體來源的嵌合體比例。h使用 CD93 + HSC 和 CD93 – HSC進行初次移植后 20 周時受者 PB 中供體來源的嵌合體比例。i在使用 CD93 + HSC 和 CD93 – HSC進行二次移植后 8 周時受者 PB 中的供體來源嵌合體比例。j使用 CD93 + HSC 和 CD93 – HSC進行二次移植后 16 周時受者 PB 中供體來源的嵌合體比例。

三、 HSC/MPP 和生態(tài)位細胞之間的細胞-細胞相互作用

利用單細胞數據構建了一個無偏的 HSC/MPP-生態(tài)位細胞相互作用網絡，重點是結構生態(tài)位細胞和巨噬細胞。深入分析確定了參與 HSC/MPP 發(fā)展的幾種眾所周知的配體-受體相互作用，例如 TGFΒ1-TGFΒR1、TEK-ANGPT1 和 IGF2-IGF1R。通過反卷積分析發(fā)現紅細胞和成肝細胞在大多數斑點中顯示出最高的富集分數，表明它們是 FL 的主要細胞成分?？傊?，ST 描繪了 FL 的空間組織結構，用以進一步解讀 scRNA-seq 預測的細胞-細胞相互作用。

圖3 HSCs/MPPs 和小生境細胞之間的細胞間相互作用

a示意圖展示 HSC/MPP 和生態(tài)位細胞（內皮細胞、基質細胞、成肝細胞和巨噬細胞）之間的細胞相互作用。b CellPhoneDB 分析展示主要的 HSC/MPP-生態(tài)位細胞相互作用對。c主要的HSC/MPP-生態(tài)位細胞相互作用對的配體（頂部）和相應受體（底部）表達模式的散點圖。d 10×Visium ST 實驗流程示意圖。e E14.5 胚胎組織切片的蘇木精和伊紅 (HE) 染色。f組織切片中成肝細胞標記物Afp 的表達模式。g熱圖展示了FL斑點的富集分數。h FL部分空間特征圖。

四、 HSC/MPP 擴增單位的識別

對于每種生態(tài)位細胞類型，不同類型斑點的富集得分分析表明，點內得分最高的 EC 接近 HSC/MPP。發(fā)現巨噬細胞在點內富集 11.52 倍，在點間富集 1.31 倍，EC 在點內富集 1.62 倍，而肝母細胞和基質細胞在點內富集較少。總之，數據結果支持巨噬細胞是與 HSCs/MPPs 關系最密切的重要生態(tài)位細胞。通過分析預測的交互信號的空間表達，發(fā)現編碼配體的基因，如 MDK 和 PTN，在點內和點間的生態(tài)位細胞中高度表達；并且與受體相關的基因，如 LRP1 和 PTPRS，在HSCs/MPPs 定位點富集。該結果證明 FL的 HSCs/MPPs 以多個單位擴增，其中巨噬細胞和多種生長因子（包括 MDK 和 PTN）高度富集。

圖4 HSC/MPP擴增單元識別

a點內、點間及其他的示意圖。點內：HSC/MPP 定位點；點間：HSC/MPP 包圍點；其他，其他遠端的點。b箱線圖展示點內、點間和其他點中生態(tài)位細胞的富集分數。c箱線圖展示了點內生態(tài)位細胞的歸一化（富集）評分。d箱線圖顯示點間生態(tài)位細胞的歸一化（富集）評分。e FL中Ptn和Ptprs 的共表達模式。f 空間特征圖展示Ptn-Ptprs豐富的 HSC/MPP 擴增單元?；騊tn在生態(tài)位細胞定位點（頂部，紅色點）和基因Ptprs在HSC/MPP 定位點（頂部，藍色點）的表達模式。g FL中Mdk和Lrp1 的共表達模式。h富含Mdk -Lrp1 的HSC/MPP 擴增單元（點間）的空間特征圖。i空間特征圖展示富含Mdk- Lrp1 的HSC/MPP 擴增單元（點內）。

五、生態(tài)位細胞在促進 HSC/MPP 擴增中的作用的功能驗證

免疫熒光分析揭示巨噬細胞可以通過形成“口袋狀”結構來促進 HSC/MPP 擴增，同時通過分泌 MDK 因子促進 HSC/MPP 擴增。10×Visium ST 結果說明了 HSCs/MPPs 和 ECs 之間更密切的空間關系，免疫熒光分析驗證了HSCs/MPPs 被 ECs 包圍。從功能上確定源自結構生態(tài)位細胞的預測交互信號可以調節(jié) HSCs/MPPs 擴增。功能分析驗證了潛在的細胞間相互作用和支持 HSC/MPP 擴增的潛在分子機制。

圖5 巨噬細胞促進 HSC/MPP 擴增

a免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 F4/80（代表巨噬細胞）和 c-Kit（代表 HSCs/MPPs）的表達。b免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 F4/80（代表巨噬細胞）和 Runx1（代表 HSCs/MPPs）的表達。C柱狀圖展示有和無細胞相互作用的 HSCs/MPPs 的比例。d免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 F4/80（代表巨噬細胞）、CD150（代表 HSCs/MPPs）、Mecom（代表 HSCs/MPPs）和 Hlf（代表 HSCs/MPPs）的表達。f源自巨噬細胞和 HSC/MPP 共培養(yǎng)系統的 HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數量。g源自MDK補充培養(yǎng)物的 100 個 HSCs/MPPs（LSK、Flt3 -LSK 和 SLAM-LSK 細胞）的HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數量。h氯膦酸鹽-脂質體和對照-脂質體處理后 E14.5 FL 中的總細胞數。i氯膦酸鹽處理前后 E14.5 FL中譜系- (Lin- ) 細胞的比例。j氯膦酸鹽處理前后 E14.5 FL 中 LSK 細胞的比例。k氯膦酸鹽處理前后 E14.5 FL 中 SLAM-LSK 細胞的比例。l流式細胞儀分析顯示E14.5 FL在氯膦酸鹽處理前后Lin -，LSK，SLAM-LSK的細胞比例。

圖6 促進 HSCs/MPPs 擴增的結構生態(tài)位細胞

a 免疫熒光分析顯示了在 E14.5 FL 冷凍切片中 Lyve1（代表ECs）和 Runx1（代表 HSCs/MPPs）的表達。b免疫熒光分析顯示了 E14.5 FL 冷凍切片中 Lyve1（代表EC）和 Runx1（代表 HSCs/MPPs）的表達。c免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 c-Kit（代表 HSCs/MPPs）、Runx1（代表 HSCs/MPPs）和 EphrinB2（代表動脈門脈血管）的表達。d免疫熒光分析顯示 c-Kit（代表 HSCs/MPPs）、Runx1（代表 HSCs/MPPs）和 EphB4（代表靜脈）在 E14.5 FL 冷凍切片中的表達。e Igfbp1、Igfbp5和Igfbp7在三種結構生態(tài)位細胞（內皮細胞、基質細胞和成肝細胞）中的表達模式散點圖。f來自 E14.5 FL 的 100 個 SLAM-LSK 細胞因子培養(yǎng)物的 HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數量。g來自 E14.5 FL的 100 個Flt3-LSK 細胞因子培養(yǎng)物的 HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數量。h來自 E14.5 FL 的 100 個 LSK 細胞因子培養(yǎng)物的 HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數量。

六、小鼠和人類FL造血功能的跨物種分析

本文數據揭示了小鼠和人類 FL 之間保守的細胞類型和造血分化途徑，說明人類和小鼠之間保留了許多 FL HSC 擴增機制，但 HSCs/MPPs 中也存在物種特異性轉錄組特征。

圖7 小鼠和人類FL造血的跨物種分析

a E14.5 FL中所有細胞類型的UMAP 可視化。b來自小鼠（E14.5）和人類（受孕后 11 周）的 FL 細胞群的 UMAP 可視化。c對人類 HSCs/MPPs中top DEG 進行 GO 生物過程相關的通路富集分析。d對小鼠 HSCs/MPPs 中top DEG進行GO生物過程相關的通路富集分析。e配體-受體相互作用網絡展示了人 HSC/MPP與生態(tài)位細胞之間的潛在通訊網絡。f熱圖展示主要的人 HSCs/MPPs-生態(tài)位細胞相互作用對。g – h免疫熒光分析展示CD68（代表巨噬細胞）和 CD34（代表 HSCs/MPPs）在人受孕后第 11 周 FL 切片中的表達。i柱狀圖展示有和無細胞相互作用的 HSCs/MPPs 所占的比例。j源自小鼠巨噬細胞和 HSCs/MPPs 共培養(yǎng)系統的人 CD34 + HSCs/MPPs的數量。

研究結論

單細胞轉錄組學揭示了三種具有轉錄異質性的亞群，其中CD93+亞群表現出增強的干細胞特性。此外，通過整合單細胞和空間轉錄組學的聯合分析，發(fā)現了新的HSCs/MPPs‘口袋樣’單元(HSC PLUS)，由生態(tài)位細胞 (肝母細胞、間質細胞、內皮細胞和巨噬細胞) 組成，并富含生長因子。出乎意料的是,巨噬細胞在HSC PLUS中表現出了11倍的富集結果。在功能上，巨噬細胞- HSC /MPP共培養(yǎng)檢測和候選分子檢測分別驗證了巨噬細胞和生長因子(MDK、PTN和IGFBP5)在HSCs/MPPs擴增中的支持作用。該研究通過高通量測序技術解讀了HSCs/MPPs擴增的結構和分子基礎。最后,跨物種分析和功能驗證表明細胞間相互作用和擴增機制具有保守性，但小鼠和人FL的HSCs/MPPs之間的轉錄組特征同時存在差異。綜上所述，本文為了解FL中HSCs/MPPs的發(fā)生發(fā)展以及體外功能性HSCs/MPPs擴增提出了的新見解。

參考文章：

Gao, S., Shi, Q., Zhang, Y. et al. Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics. Cell Res (2021). https://doi.org/10.1038/s41422-021-00540-7

原文下載鏈接：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34341490