單細胞多組學占領高分“陣地”- 人動脈粥樣硬化斑塊的轉錄和表觀基因組特征

為了研究人類動脈粥樣硬化斑塊的轉錄組學，對18例患者(男性77%)的頸動脈內膜切除組織進行了酶消化，通過熒光激活細胞分選(FACS；圖1A)分離出活的有核細胞，并制備了scRNA-seq文庫。在根據報告基因的數量過濾細胞后，我們對3282個細胞進行了無偏聚類，確定了14個細胞群體(圖1B和1C)。我們的scRNA-seq數據與大量RNA-seq數據的相關性，以及患者間群集分布的變異，證實了數據的一致性，但患者1除外。

我們觀察到3個非免疫細胞簇(簇8，9和10；表達CD34和ACTA2[肌動蛋白α2，平滑肌])和11個白細胞簇(圖1B和1D)。后者包括5個淋巴細胞簇(第0、1、3、4、11簇；表達CD3E、CD4、CD8、CD79A)，5個髓系簇(第5、6、7、12和13簇；表達CD14、CD68、KIT)，和1個沒有明確的細胞類型表達譜的混合細胞的簇(第2簇)，但與其他簇有相似的基因表達，似乎主要含有凋亡的髓系細胞和T細胞(圖1B和1D)。T細胞是我們數據集中豐富的群體，占所有分析細胞的52.4%，而髓系群體占所有細胞的18.5%。

圖1

對ECs群集進行分離和重新聚類后，發(fā)現了4個不同的子類(E.0-E.3，圖2A)。我們通過標記基因將EC表型分為不同的亞類(圖2B)。在E0小鼠中，ACKR1有明顯的表達，ACKR1與靜脈內皮細胞和血管相關，PRCP參與了血管生成和受損內皮細胞的再生(圖2B和2C)。E.1表達細胞外基質基因，E.2表達細胞遷移標記FGF18和HEG1，這兩個群體都表達VCAM1，它在激活的內皮細胞表達，促進白細胞(如單核細胞和T細胞)的黏附和遷移(圖2C)。這表明E.0、E.1和E.2代表著激活的內皮細胞，它通過細胞黏附和新生血管以及介導白細胞外滲，積極活躍地加重晚期病變的炎癥。值得注意的是，E.3亞群表達典型的SMC標記物，如ACTA2、NOTCH3和MYH11 (圖2C)。

EC簇之間的聚集以及SMC相關通路的富集(圖2D)，表明這個亞群可能正在經歷內皮細胞向間充質細胞的轉變，或者反之亦然。為了驗證這些發(fā)現，我們觀察了ACTA2和CD34在連續(xù)的組織學切片上的表達(圖2E)。

圖2

第8簇代表SMCs，分為2個亞類：一簇具有收縮特性的SMC(簇S.1；表達MYH11、ACTA2和TAGLN)和一簇合成型的SMCs(簇S.0；表達COL1A1、MGP和COL3A1。S0簇中典型的SMC標志物的低表達和細胞外基質基因的上調表明，這些細胞一部分來自斑塊已建立的帽狀部分。這一簇中的有限數量的細胞是KLF4⁺，這表明血管平滑肌細胞分化為合成的或巨噬細胞樣表型。

為了更詳細地定義T細胞，我們分離和重新聚類CD4⁺T細胞，發(fā)現了5個亞類(CD4.0-CD4.4，圖3A)，其中主要的區(qū)別是它們的激活狀態(tài)，而不是通常用于定義CD4⁺T輔助亞群的轉錄因子和細胞因子(圖3B和3C)。CD4.0和CD4.1具有細胞毒基因表達譜，此外，這一簇中的基因表達證實了與適應性免疫反應相關的促炎通路的富集（圖3D)。

根據經典標記物FOXP3(轉錄因子P3)、IL2RA(CD25)和CTLA4的表達(圖3B)，最終的CD4⁺亞類(CD4.3)被鑒定為調節(jié)性T細胞簇。對CD8⁺T細胞的分析揭示了3個亞類，它們與由激活狀態(tài)不同定義的CD4⁺T細胞相似。這表明最近T細胞受體(TCR)被激活，表明CD8⁺T細胞亞群對斑塊特異性抗原有反應，可能與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制更相關。

圖3

我們分離和重新聚類動脈粥樣硬化性髓系細胞，揭示了5種不同的表型(My.0-My.4，圖4A)。My.0、My.1和My.2很可能代表不同激活狀態(tài)的巨噬細胞。促炎標志物基因(圖4B)以及免疫和炎癥通路的富集結果(圖4C)表明，My.0和My.1亞類由促炎巨噬細胞組成。My.0顯示了最近招募的巨噬細胞的特征(圖4C，D)，表明共表達的炎癥體被激活(圖4B)。與My.0和My.1相比，My.2缺乏明顯的促炎標志物，并顯示巨噬細胞和泡沫細胞的跡象。

為了進一步確定這3個亞類的特征，我們接下來通過獨創(chuàng)性的通路分析(圖4E)研究了每個群體差異富集的通路(圖4D)，以及可能管理這些群體的上游調節(jié)因子。My.0和My.1顯示典型炎癥和免疫通路的富集，清楚地表明細胞激活、募集和免疫細胞相互作用驅動了它們的表型。同時預測My.0和My.1主要受促炎因子控制，如IL1A、干擾素(干擾素)A、IFNG和IL1B。

總之，這證實了我們分別為My.0和My.1定義的最近遷移和嵌入的炎癥表型，并與我們在My.2中看到的泡沫表型相匹配。它還展示了人類患者和小鼠模型在細胞類型多樣性方面的良好一致性。

圖4

接下來，我們基于CellPhone?DB v2.0檢查了不同細胞類型之間潛在的配體-受體相互作用，以預測病變內的細胞間通訊。淋巴細胞和肥大細胞的潛在相互作用的絕對數低，而髓系細胞、內皮細胞和平滑肌細胞的相互作用的絕對數高(圖5A)。

隨后，我們按髓系配體(圖5B)和受體(圖5C)明確地檢查了髓系群體中獨特的相互作用。發(fā)現了多種趨化作用，包括內皮ACKR1與髓系來源的CCL2、CXCL8、CCL8和CXCL1的相互作用，其中最后兩個配體在My.1中特異性表達。我們還觀察到在所有髓系亞群中的CSF1R，與在內皮細胞、平滑肌細胞、肥大細胞和髓系細胞中的CSF1有相互作用。

圖5

利用scATAC-seq，我們檢測了人類斑塊中髓系和T細胞的開放染色質啟動子和增強子圖譜。我們用scATACseq鑒定了4個髓系細胞簇和5個T細胞簇 (圖6A和6B)。巨噬細胞(CSF1R，IL1B)和T細胞特異性基因(NKG7)的開放染色質，以及巨噬細胞和T細胞(SPI155和ETS156)的細胞型TFs的motif的富集，明確了細胞類型之間的劃分界限(圖6C和6D)。轉移的髓系群體被重新聚類，類似于scRNA-seq簇(圖6E)。

IRF4已被證明是CD1c⁺樹突狀細胞特異性轉錄調節(jié)因子，其motif確實在My.3中富集(圖6F)。與scRNA-seq數據一致，My.1顯示了促炎因子motif的富集(圖6F)，這與在這些細胞中看到的促炎基因表達相匹配。在scATAC-seq數據中，My.0細胞特異性地富含NFATC3 的motif(圖6F)，這是一種先前被認為與激活的TLR通路信號有關的TF。My.2細胞富含抗炎的泡沫細胞相關的TFs，這和scRNA數據中是相似的。

我們觀察到含有KLF4的motif位點的染色質可及性增加，被證明實現了抗炎巨噬細胞激活狀態(tài)，并參與血管平滑肌細胞向巨噬細胞的轉化(圖6F)。

圖6

我們將317個CAD相關的基因與3876個差異表達基因進行了交集，共有74個基因。同時觀察到GWA的連鎖基因在3、8和14模式中顯著積累(圖7B)。模式3中的基因與EC簇9和10中的高表達相關(圖7C)，模式8的特點是有與4個巨噬細胞群相關的基因表達(圖7A)，包含AMPD2、CTSS、IL6R、CAPG、GPX1、GNAI2、TRIB1、SH2B3、FES、C19orf38和Vasp(圖7B和7D)。模式14中基因的高表達主要與平滑肌細胞群8和CD34⁺EC第10簇群體相關(圖7E)。我們的結果表明，巨噬細胞、平滑肌細胞和內皮細胞是功能測試的出發(fā)點。

?圖7