1、提取方法

1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號：DP441）

2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒

3)動(dòng)物常規(guī)組織：TRIzol

4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號：217004）

5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號： Nanodrop2000）對于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測，并使用LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進(jìn)行檢測

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)RIN 值≥4.0（非植物），RIN 值≥4.0（植物），同時(shí)若 GX 檢測 6.0-4.0 的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、建庫方法

3.1rRNA去除

1) rRNA與探針結(jié)合

A.將對應(yīng)物種的去rRNA探針混合物加入到準(zhǔn)備好的總 RNA 樣品中，混勻離心，68℃孵育確保RNA變性

B.孵育結(jié)束后，將PCR管置于室溫，孵育2 min

2)rRNA探針復(fù)合物的捕獲與去除

A.吸取 RRB（rRNA Removal Beads）至新1.5 mL Nuclease-free離心管中

B.將上步中的RNA/Probe混合物轉(zhuǎn)入RRB中并立即迅速混勻，然后再渦旋混勻，室溫孵育5 min

C.孵育結(jié)束后再中速渦旋，然后置于磁力架上2 min至上清液澄清

D.轉(zhuǎn)移上清液到新離心管中，補(bǔ)加Nuclease-free Water，置于磁力架上至上清液澄清，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中

3) rRNA-depleted RNA的純化及打斷

A.向上述反應(yīng)產(chǎn)物加入相應(yīng)體積的（1.8X）已混勻的磁珠，混勻，室溫孵育而后置于磁力架上，待磁珠吸附到磁力架一側(cè)后移棄上清液

B.向反應(yīng)管中加入新鮮配制的80% ethanol，磁力架上靜置30s，移棄上清液，重復(fù)該步驟1次

C.打開管蓋，空氣干燥至磁珠表面無光澤，有細(xì)微裂紋，加入Frag/Prime Buffer洗脫，吹吸混勻，室溫靜置，磁力架上靜置，轉(zhuǎn)移至新的Nuclease-free 0.2 mL離心管中，PCR儀高溫打斷，打斷完成后立即放在冰上

3.2合成 cDNA 第一條鏈

向上步反應(yīng)的離心管中加入反轉(zhuǎn)錄合成所需的試劑1st Strand Buffer 2、1st Strand Enzyme Mix 2及Actinomycin D (5mg/ml)，混勻離心后放入PCR儀中設(shè)定好程序進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。

3.3合成 cDNA 第二條鏈（含末端修復(fù)及接頭連接）

1)向合成的 cDNA 第一條鏈產(chǎn)物中依次加入二鏈合成反應(yīng)的試劑2nd Strand Buffer 2（with dUTP）、2nd Strand Enzyme Super Mix，混勻離心后，放在PCR儀中孵育完成二鏈的合成

2)運(yùn)行結(jié)束后加入末端修復(fù)及接頭連接的試劑：Rapid Ligation Buffer 3、Rapid DNA Ligase 2及IDT接頭，混勻離心后，放在PCR儀中運(yùn)行程序

3.4末端修復(fù)及 3’-末端加A

向上述純化產(chǎn)物中加入末修試劑，放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，立即進(jìn)行接頭連接

3.5連接接頭及產(chǎn)物純化

1)向上述反應(yīng)產(chǎn)物加入0.9X已混勻的磁珠，混勻，室溫孵育而后置于磁力架上，待磁珠吸附到磁力架一側(cè)后移棄上清液

2)離心管置于磁力架上，加新鮮配制的 80% ethanol，靜置 30s，移棄上清液

3)重復(fù)步驟 2 一次，第二次清洗后離心用 10ul 槍頭將上清液去除干凈

4)離心管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥

5)取下離心管，加入Nuclease-free Water，混勻，室溫孵育，而后置于磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的 離心管中

3.6PCR 擴(kuò)增

向上述離心管中加入 PCR 反應(yīng)所需的各種試劑，混勻后離心，根據(jù) PCR 反應(yīng)條件，放入 PCR 儀中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增

注意：primer中包含Index序列，使用時(shí)需嚴(yán)格按照上機(jī)調(diào)度安排的序列添加

3.7PCR 產(chǎn)物純化

1)瞬時(shí)離心 PCR 反應(yīng)管，加入相應(yīng)體積的磁珠，充分混勻

2)室溫孵育，然后置于磁力架上靜置，小心移除上清液

3)向反應(yīng)管中加入新鮮配制的 80% ethanol ，磁力架上靜置 30s ，移棄上清液，重復(fù)該步驟 1 次

4)打開管蓋，磁珠干燥后加入 Nuclease-free Water 洗脫 DNA ，吹吸混勻，室溫靜置，磁力架上靜置，小心 吸取上清至新的離心管中，并分裝 1.5 μL 于新的 1.5 mL 離心管中用于片段檢測，-20℃保存

3.8文庫質(zhì)檢

文庫通過 Qsep-400 方法進(jìn)行質(zhì)檢，滿足如下指標(biāo)即可上機(jī)檢測：

3.9引物接頭序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.10建庫試劑耗材

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)，貨號N406-01

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Plant)，貨號N409-02

1)文庫構(gòu)建試劑盒

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)，貨號N406-01

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Plant)，貨號N409-02

2)產(chǎn)物純化磁珠

VAHTSTM DNA Clean Beads，貨號N411-03

VAHTSTM RNA Clean Beads，貨號N412-02

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.11建庫設(shè)備

4、測序方法

測序設(shè)備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTM X? Series25B Rgt Kit

英文名:Long Non-coding RNA Derived from lncRNA– mRNA Co-expression Networks Modulates the Locust Phase Change

期刊：Genomics Proteomics Bioinformatics

IF：7.051（1區(qū)）

通訊作者單位：中科院、河北大學(xué)

研究背景

長鏈非編碼RNA（lncRNA）調(diào)節(jié)基因表達(dá)、動(dòng)物行為等各種生物學(xué)過程。盡管蛋白質(zhì)編碼基因、microRNA和神經(jīng)肽在亞洲飛蝗的表型可塑性調(diào)節(jié)中起著重要作用，但有關(guān)lncRNA在此過程中功能研究較少。本文應(yīng)用高通量RNA-seq來比較蝗蟲型變時(shí)程中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)模式。結(jié)果顯示lncRNA在型變的早期階段反應(yīng)更快。功能注釋表明，早期改變的lncRNA在分散和群居階段采用了不同的途徑來應(yīng)對種群密度的變化。篩選了分散和群居階段的網(wǎng)絡(luò)中兩個(gè)重疊的中樞l(wèi)ncRNA基因座進(jìn)行功能驗(yàn)證。本文進(jìn)一步證明LNC1010057為潛在的蝗蟲型變因子。這項(xiàng)工作為深入了解蝗蟲型變的分子機(jī)制并擴(kuò)大lncRNA在動(dòng)物行為中的作用范圍提供了重要的數(shù)據(jù)。

材料方法

實(shí)驗(yàn)材料：散居化處理為將群居型蝗蟲單獨(dú)飼養(yǎng)0h、4h、8h和16h后取出手機(jī)蝗蟲大腦進(jìn)行測序；

群居化處理為將10只散居型蝗蟲與20只群居型蝗蟲飼養(yǎng)于一個(gè)小籠子（10厘米×10厘米×10厘米）中，于0h、4h、8h和16h后取出，收集蝗蟲大腦進(jìn)行測序。在同一時(shí)間點(diǎn)采集樣品的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，提取RNA，建立cDNA文庫并進(jìn)行RNA-seq。對lncRNA和mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析及qRT-PCR驗(yàn)證，對不同時(shí)間點(diǎn)的樣本進(jìn)行STEM(ShortTime-seriesExpressionMiner)分析，并構(gòu)建lncRNA–mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。對目標(biāo)中心節(jié)點(diǎn)lncRNA進(jìn)行RNAi，采集其行為錄像數(shù)據(jù)進(jìn)行行為數(shù)據(jù)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、蝗蟲lncRNA的外顯子比mRNA少但更長

研究發(fā)現(xiàn)大約78％的lncRNA包含2個(gè)外顯子，而mRNA中包含的外顯子數(shù)量為1至120（圖1C）。因此，lncRNA的外顯子明顯長于mRNA的外顯子（平均長度1142bpvs.263bp，圖1D，左）。同時(shí)，lncRNA的內(nèi)含子明顯短于mRNA的內(nèi)含子（平均長度：10086bpvs.12442bp，圖1D，右）。表達(dá)水平分析表明，lncRNA的總體表達(dá)水平明顯低于mRNA的表達(dá)水平（平均值為0.6vs.1.9；圖1E）。但是，表達(dá)特異性分析表明，lncRNA的表達(dá)受時(shí)間限制的程度要高于mRNA（平均值為0.672對0.436圖1F）。基于相對于mRNA的lncRNA基因組位置，蝗蟲lncRNA被分類為基因間、重疊區(qū)、有義內(nèi)含子、反義內(nèi)含子、有義外顯子和反義外顯子?；认x77％以上的lncRNA是長基因間的ncRNA（lincRNA，圖1G）。這些結(jié)果表明，蝗蟲lncRNA與mRNA在結(jié)構(gòu)和表達(dá)上有很大不同?；认xlncRNAs更長，具有更少但更長的外顯子和更短的內(nèi)含子。此外，lncRNA的表達(dá)模式顯示出比mRNA更高的時(shí)間特異性。

圖1lncRNA和mRNA之間的不同結(jié)構(gòu)和表達(dá)

2、群居型蝗蟲中特異性表達(dá)的lncRNA比在散居型蝗蟲中表達(dá)的更多

在散居型和群居型蝗蟲大腦中共表達(dá)9722個(gè)lncRNA（73.9％），而散居型蝗蟲中特異性表達(dá)962個(gè)lncRNA（7.3％），群居型蝗蟲中特定表達(dá)2469個(gè)lncRNA（18.8％）（圖2A，頂部）。分別在散居型和群居型蝗蟲中特異性表達(dá)了479和1090個(gè)mRNA（3.1％和7.1％）（圖2A，底部）。這些結(jié)果表明，與mRNA相比，在兩個(gè)蝗蟲相型特異性表達(dá)的lncRNA的百分比更高，而在群居蝗蟲中比散居型蝗蟲中表達(dá)的lncRNAs更多。與散居型蝗蟲相比，群居型蝗蟲中335個(gè)lncRNA和779個(gè)mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，而313個(gè)lncRNA和261個(gè)mRNA的表達(dá)上調(diào)[倍數(shù)變化（FC）>2和P<0.05；圖2B]。lincRNA在下調(diào)和上調(diào)的lncRNA中所占的比例高（分別為81.2％和87.8％），其次分別是反義外顯子和有義內(nèi)含子lncRNA（圖2B）。在表達(dá)中按FC排名的前10個(gè)lncRNA基因顯示在圖2C中。這表明散居型和群居型蝗蟲大腦中表達(dá)的lncRNA的數(shù)量及其表達(dá)水平明顯不同。

圖2lncRNA在蝗蟲型變中顯示出不同的表達(dá)變化模式

3、lncRNA對種群密度變化的快速應(yīng)答

為了進(jìn)一步分析lncRNA和mRNA的表達(dá)模式，使用了短時(shí)間序列表達(dá)挖掘器（ShortTime-seriesExpressionMiner，STEM）對基于表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類。在CS期間，將214個(gè)lncRNA和242個(gè)mRNA分別分為8個(gè)和9個(gè)重要的表達(dá)譜（圖3D）。其中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜15以及mRNA表達(dá)譜15、13和16直到群居化處理后8或16小時(shí)才改變。這些配置文件稱為后期更改的配置文件（模式d）。與后期更改的配置文件相反，早期更改的配置文件以4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)開始的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化為特征。根據(jù)4小時(shí)后的表達(dá)變化，將早期變化的輪廓細(xì)分為模式a（早期變化）、模式b（早期中變化）和模式c（可持續(xù)變化）。在IG過程中，269個(gè)lncRNA和639個(gè)mRNA分別聚集成6個(gè)和7個(gè)顯著表達(dá)譜。所有l(wèi)ncRNA配置文件均為早期變化（圖3E）。在mRNA表達(dá)譜中，有6個(gè)是早期改變的，而譜12是晚期改變的。在CS和IG期間，lncRNA的聚類分布圖的數(shù)量與mRNA的分布無明顯差異。但是，通過計(jì)算譜圖中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，發(fā)現(xiàn)早期改變的lncRNA的百分比比CS中的mRNA的百分比高61.1％（88.3％vs.54.8％，圖3F）。同樣，IG中早期改變的lncRNA的百分比高于IG中的mRNA（100％vs.81.3％，圖3F）。因此，lncRNA比mRNA對散居化和群居化處理的反應(yīng)更快。在CS中，早期改變的lncRNA的表達(dá)變化速率快于285個(gè)mRNA的表達(dá)變化速率（0.55vs.0.24）和IG（0.77vs.0.39）（圖3G）。因此，早期改變的lncRNA的比例和表達(dá)變化率高于早期改變的mRNA。因此，蝗蟲lncRNA比mRNA對種群密度的變化更敏感。

圖3lncRNA對散居化和群居化處理的快速反應(yīng)

4、lncRNA參與CS和IG早期變化的不同途徑

在CS中，自噬調(diào)節(jié)、剪接體和肌醇磷酸代謝途徑在上位和至少兩個(gè)模塊中均過代表（圖4C）。因此，CS中早期改變的lncRNA可能在調(diào)節(jié)自噬、RNA剪接和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。lncRNA對自噬的調(diào)控參與了群居化的初期和中期，而對剪接體和磷酸肌醇代謝的調(diào)控則參與了整個(gè)過程。與神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)的突觸小泡循環(huán)途徑的lncRNA僅在模式a（早期改變）模塊中被過代表（圖4C）。該結(jié)果表明，早期改變的lncRNA可能在CS期間調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用。此外，一些lncRNA與已知的型變相關(guān)基因密切相關(guān)。例如，早期改變的lncRNALNC531328.2、LNC1425451.2、LNC1088763.7和LNC492755.1與基因NPYR、NPF1a和Vat1相關(guān)（圖4A）。持續(xù)變化的lncRNALNC494161.1和LNC1065048.14與多巴胺途徑中的基因Ebony和Vat1相關(guān)。在CS網(wǎng)絡(luò)中，程度值前5％的lncRNA被視為hublncRNA（圖4A）。計(jì)算了lncRNA基因座的程度值，在CS中，基于度數(shù)排名前5％的10個(gè)lncRNA基因座被鑒定為hublncRNA。其中，四個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，其他六個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖4D）。在IG期間，包括谷氨酸能突觸、多巴胺能突觸和膽堿能突觸途徑在內(nèi)的與突觸有關(guān)的途徑得以豐富。這些途徑中的大多數(shù)都富含早期改變的模塊。同時(shí)，多巴胺能突觸和膽堿能突觸途徑僅參與模式a（早期改變）的模塊（圖4E）。IG中也豐富了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如鈣信號傳導(dǎo)、Ras信號傳導(dǎo)、胰島素信號傳導(dǎo)和MAPK信號傳導(dǎo)途徑。功能注釋的結(jié)果表明，與CS相比，IG中早期變化的lncRNA參與的突觸相關(guān)和信號處理途徑更多。

圖4早期改變的lncRNA參與CS和IG的不同途徑

5、LNC1010057可能調(diào)節(jié)蝗蟲型變

為為了驗(yàn)證LNC1010057和LNC992414在蝗蟲型變中的功能，進(jìn)行了一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。首先，克隆了在LNC1010057和LNC992414基因座中鑒定出的長的轉(zhuǎn)錄本。LNC1010057由重復(fù)的A、B和C元素組成，這些元素依次分布并重復(fù)4次，但C元素重復(fù)三次（圖5A）。序列比對證明LNC992414在5’端與LNC1010057共享相似的重復(fù)序列，但是它們是從不同的基因組基因座轉(zhuǎn)錄而來的（圖5A）。盡管LNC992414的定量表達(dá)水平可以通過特異性引物檢測，但LNC1010057的表達(dá)水平為重復(fù)元件的總表達(dá)水平。如預(yù)期的那樣，LNC1010057和LNC992414的表達(dá)模式極為相似。在CS期間，兩種lncRNA的表達(dá)持續(xù)增加，并且在16h幾乎增加了四倍（圖5B）。在IG期間，4h后表達(dá)水平顯著下降，之后保持相對穩(wěn)定（圖5B）。LNC1010057和LNC992414之間的序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式的相似性表明它們是同源的lncRNA。但是，實(shí)時(shí)qPCR分析表明，在散居型和群居型蝗蟲的大腦中，LNC1010057的表達(dá)水平比LNC992414的表達(dá)水平高約1000倍（圖5C）。其次，為了測試LNC1010057和LNC992414是否參與蝗蟲型變調(diào)節(jié)，在通過RNAi抑制蝗蟲大腦中的表達(dá)后進(jìn)行了行為分析。顯著降低LNC1010057的表達(dá)水平（7470對3764610）和LNC992414（1.9vs.1.0）（圖5D）后行為分析表明，群居型蝗蟲其行為顯著改變?yōu)樯⒕訝顟B(tài)（圖5E）。此外，多個(gè)與型有關(guān)的行為參數(shù)發(fā)生了變化?？傄苿?dòng)距離（TDM）和總移動(dòng)持續(xù)時(shí)間（TDMV）顯著降低（圖5F），但是，移動(dòng)速度沒有區(qū)別。同時(shí)群居蝗蟲的特定喜好行為顯著下降（58.3對-13.5圖5F）。但LNC992414表達(dá)降低并未引起從群居狀態(tài)到散居狀態(tài)的轉(zhuǎn)變（圖5G和H）。與對照相比，與型相關(guān)的行為參數(shù)（包括運(yùn)動(dòng)和特定物種的優(yōu)選行為）沒有差異（圖5I）。LNC992414的RNAi實(shí)驗(yàn)不會(huì)引起行為變化，因此排除了LNC992414調(diào)節(jié)蝗蟲型變的可能性。這些結(jié)果表明是LNC1010057而不是LNC992414潛在地調(diào)節(jié)了蝗蟲的型變。

圖5LNC1010057潛在地調(diào)節(jié)了蝗蟲的型變

總結(jié)

lncRNA被證實(shí)是生物過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，調(diào)節(jié)包括mRNA轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定性、翻譯和翻譯后修飾等多種生物途徑。之前研究表明昆蟲lncRNA參與了例如殺蟲劑抗性、繁殖力和腺體凋亡等生物過程，但是尚未有證據(jù)證明lncRNA可以調(diào)節(jié)非模型昆蟲的行為?；认x是世界范圍內(nèi)的一種農(nóng)業(yè)害蟲，表現(xiàn)出顯著的表型可塑性。為了鑒定與其型變相關(guān)的lncRNA，本文系統(tǒng)地分析了蝗蟲lncRNA的表達(dá)并注釋其功能，證實(shí)與mRNAs相比lncRNAs顯示對型變更敏感的響應(yīng)，并證實(shí)了其中一個(gè)lncRNA可調(diào)節(jié)型變相關(guān)行為。本研究揭示了lncRNA在蝗蟲型變中的重要作用以及表型中蛋白編碼基因和lncRNA之間的相互作用。深入解析蝗蟲散居型和群居型轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，為可持續(xù)治理蝗蟲的新策略和新方法的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。