1.1 適用范圍

本指南介紹百邁客實驗平臺空間轉錄組產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請詳細閱讀。

1.2 聲明

我國法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風疹、麻風病、急性出血性結膜炎、黑熱病、絲蟲病、包蟲病、還有除了霍亂、細菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

涉及上述傳染病的科學研究需符合國家的相關規(guī)定，為嚴格遵守國家法律法規(guī)，本著對社會及相關操作人員負責的態(tài)度，我司要求客戶方真實準確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進行事先說明。樣品中含有上述感染性病原體時，客戶方需要提供符合生物安全等級要求的實驗室以便開展相關實驗，實驗進行時，客戶方有義務協(xié)助我方實驗員做好實驗安全防護。客戶方不得隱瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)我司將停止進行相關項目，已產(chǎn)生的費用由客戶方承擔。如因客戶方提供的生物安全性信息不實、隱瞞樣品感染性等有關情況等造成實驗員及相關人員被感染、疾病傳播等嚴重后果的，我司將按規(guī)定報告國家相關部門，并將通過法律等手段追究相關責任。

2、項目流程

目前百邁客空間轉錄組測序服務模式默認為組織寄送模式，如果有特殊情況需要上門服務，請與百邁客技術人員確認實驗室儀器設備情況。

組織寄送前請至少提前1周進行預約，百邁客接收到樣本并確認樣本無異常后，3-5天內(nèi)安排RNA質檢并反饋質檢結果，質檢合格后安排切片、組織結構確認與透化。

圖 1 百邁客新鮮冷凍樣本空間轉錄組服務流程

3、新鮮冷凍樣本

3.1 樣本要求

10x空間轉錄組每塊組織樣本長寬不宜超過6.5*6.5mm，百創(chuàng)S3000空間轉錄組每塊組織樣本長寬不宜超過6.8*6.8mm，厚度＞1.5mm，S2000A空間轉錄組每塊組織樣本長寬不宜超過11*11mm，組織截面覆蓋小于25%的組織，建議多個包埋成一個OCT包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個組織保持在一個水平面充分利用捕獲區(qū)域。

注1：在樣本量足夠的情況下，每個動物樣本最好準備至少2個包埋塊，1份用于RNA質檢（切片質控標準見第3部分）、切片選片、上透化芯片和表達芯片，另1份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

注2：在樣本量足夠的情況下，每個植物樣本最好準備至少3個包埋塊，因植物組織目的結構較薄，實驗建議進行全流程方案進行空間實驗，即一個包埋塊在一次切片實驗中完成結構確認，貼片表達，貼片透化，避免反復切片導致結構損失，其余2塊用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

3.2 樣本采集與運輸

3.2.1 采集前準備

1. 所有器械和環(huán)境需要消毒滅菌，所有器械（如剪刀、鑷子等）需要冰上預冷；
2. 在醫(yī)用托盤上放一層冰，然后覆蓋上一層錫箔紙，再鋪幾層無菌布，將個體放在無菌布上進行取樣，保持整個取樣過程在低溫中進行，可以延緩核酸的降解，（動物組織建議針對活體或剛死亡個體進行解剖取樣）；
3. 動物組織如果取樣后無法立即進行后續(xù)包埋實驗，可以將樣本清理干凈后，暫時放入組織保護液（美天旎，貨號130-100-008）或DPBS或生理鹽水中并置于4℃冰箱暫存，暫存時間最長不要超過5h，以免造成RNA降解，RIN值質檢不合格；
4. 使用指定品牌的OCT（櫻花牌-4583）或OCT（leica-FSC 22）進行包埋，OCT使用前在冰上預冷30分鐘。

3.2.2 動物樣本采集

1. 取下新鮮組織，立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈）；
2. 迅速用預冷的 PBS溶液（RNase?free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈，然后用無菌紗布吸凈表面液體；
3. 如果組織體積較大，需要將組織切成長寬＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊，用7*7*5mm的特小號包埋盒進行包埋；取下的組織應立即進行后續(xù)包埋實驗。

注：原則上實驗室不提供組織冷凍包埋相關試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運營確認實驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運送，實驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.3?植物樣本采集

1. 培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本：在無菌超凈臺中取出組織，去除組織表面附著的培養(yǎng)基，用超純水將組織表面清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀將目標區(qū)域外的組織結構盡量去除，若組織內(nèi)部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
2. 土壤培養(yǎng)樣本：將組織從培養(yǎng)土中完整取出，去除土壤及雜質，用超純水將組織表面土壤及雜質徹底清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀將目標區(qū)域外的組織結構盡量去除，若組織內(nèi)部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
3. 將目標組織按照不同組織類型包埋方法進行包埋

注：原則上實驗室不提供組織冷凍包埋相關試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運營確認實驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運送，實驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.4?動物組織速凍包埋

下文提供了2種包埋方法：干冰包埋法、異戊烷+液氮包埋法，客戶可根據(jù)實驗條件進行選擇。干冰包埋法適合更多的組織類型，是最常用的包埋方法，也可以得到較好的切片結果；異戊烷+液氮包埋法，可以快速降溫，保護細胞完整性，但操作較復雜，而且異戊烷對人體有一定的健康危害，一些較小、較輕的樣本如穿刺樣本推薦使用液氮+異戊烷的方法進行冷凍包埋。

方法1干冰包埋法（常用）

無需異戊烷，直接用干冰粒進行包埋。

1. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
2. 標記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；
3. 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
4. 冰上預冷鑷子，將組織放入OCT中，調整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除，以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；
5. 將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會影響組織的方向，同時能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結變白（如下圖，右）。
6. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。

方法2?異戊烷+液氮包埋法

腦組織等容易形成冰晶或者水腫病變組織推薦使用此方案進行包埋。

1. 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育15分鐘；
2. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
3. 標記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；
4. 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
5. 冰上預冷鑷子，將組織放入OCT中，調整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除。以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；
6. 用鑷子將包埋盒放到異戊烷上，不要使異戊烷浸入包埋盒內(nèi)，直到組織凍結，冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化（如下圖）；
7. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰運輸。

3.2.5 植物組織速凍包埋

下文提供了 3 種包埋方法，根據(jù)植物組織的部位不同，我們推薦了不同的包埋方式：

方法一?：抽真空+干冰冷凍OCT包埋（不需要固定）

1）按照2.3植物采樣方法裁取樣本，空隙較多組織（花苞、莖尖）需將組織部分切開，目標區(qū)域外組織需盡可能全部去除。

2）將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。

3）冰上預冷75% OCT包埋劑溶液（5mlOCT+2.5ml滅菌水顛倒混勻），1.5ml離心管中加入1ml 75%OCT，將植物組織浸潤在其中，將平底的無吸附膜的吸附柱放入1.5ml離心管中，以防止抽真空過程組織上浮在OCT表面，打開所有管蓋，置于真空濃縮儀中（注意配平）。室溫抽真空10min，摸索設置成V-AQ，促進OCT溶液充分包裹和進入組織空隙中，保證OCT填充包埋組織的完整性。如下圖：

4）將包埋盒放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

5）在冰上用鑷子輕輕夾住組織，輕輕擦拭表面的OCT，緩慢放入預冷的含OCT的包埋盒中 ，加預冷的OCT直至完全包裹組織，并調整組織在OCT中的位置 ，保證目標平面與切面水平一致，如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起，此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。

6）將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會影響組織的方向，同時能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結變白（如下圖，右）。

7）將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。

方法二?：直接冷凍OCT包埋（無需抽真空）

1. 按照2.3植物采樣方法裁取樣本
2. 將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。
3. 將包埋盒放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。
4. 在冰上用鑷子輕輕夾住組織 ，緩慢放入預冷的OCT包埋劑中 ，直至OCT完全包裹組織。
5. 調整組織在OCT中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標平面與切面水平一致。如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。
6. 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育5- 10分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結 。（若無異戊烷及液氮可使用干冰包埋）
7. 用鑷子夾住包埋盒置于預冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒）或干冰上，然后等待OCT凝固變白。
8. 將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標記，利用干冰運輸。

方法三?：石蠟包埋

石蠟包埋請使用百邁客專用試劑盒(試用裝)，此試劑盒適用于主根、莖、幼果（含水量大）等組織類型，OCT切片破碎的組織也可以使用此試劑盒嘗試包埋切片。

詳細操作步驟請查看試劑盒說明書（此試劑盒目前為試用裝，未正式發(fā)布，有需求可溝通銷售）

3.2.6?樣本寄送運輸

包埋后的組織用錫箔紙包住，放入密封袋中密封，放入樣本盒在液氮或者-80℃冰箱長期保存，或者放置在干冰上進行冷凍運輸，寄送到百邁客實驗室，干冰寄送推薦用量約5kg/日。

不規(guī)范送樣示例：

A.包埋時組織放置靠近最下層，組織未被OCT包裹，導致樣本RNA降解，質檢不合格；

B.組織暴露在空氣中，導致樣本降解，組織兩側無OCT支撐，展片時可能會破壞樣本結構；

C.組織較小，不滿足做表達最小25%的要求；

D.同一個包埋塊包埋了多個樣本，但不在同一個平面，并且每一個樣本組織過小，覆蓋區(qū)域有限，可能導致分析有效數(shù)據(jù)偏低。

3.3?切片質控標準

• 組織形態(tài)學檢測：對動物組織切片進行H&E染色，對植物組織切片進行甲苯胺藍染色，觀察是否獲取到目標區(qū)域，組織形態(tài)完整性是否在可接受范圍內(nèi)（例如是否有大的裂痕，存在明顯的空泡、褶皺等）。
• RNA完整性檢測：收取10-15張切片，利用Agilent2100對樣本進行RNA完整性檢測，要求RNARIN≥6，則認為樣本完整性滿足實驗要求，可以進行后續(xù)實驗。具體切片質檢量如下：

1）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的1/5-1/4，質檢量要求~20張（左圖）；

2）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的＞1/3，質檢量要求~15張（右圖）。

3.4 測序數(shù)據(jù)量推薦

測序數(shù)據(jù)量：10x Genomics推薦60G/樣，百創(chuàng)S3000推薦250G/樣；

測序平臺：SURFSeq?5000

研究背景

大白菜是一種重要的結葉蔬菜作物。在抽穗期，葉片內(nèi)外表現(xiàn)出明顯的形態(tài)分化。然而，這種復雜的葉片形態(tài)分化的遺傳控制仍不清楚。

研究目的

在此，作者研究了抽穗期連續(xù)的頭葉從內(nèi)到外的轉錄組譜，通過在24個不同的葉片組織中展示了全基因組基因表達的序列-空間剖面，確定了可能在葉片抽穗中發(fā)揮重要作用的關鍵過渡頭葉片，為葉狀頭部的形成提供新見解。

材料方法

在溫室盆栽大白菜，使用11周大的植物進行取樣。隨機選擇兩個正常生長的大白菜。從外葉到內(nèi)葉的所有頭葉（葉長>2cm）按順序分離收集，而帶有莖尖分生組織(SAM）的幼葉和小內(nèi)葉（葉長<2cm）不分離，按順序收集。從每個大白菜頭部共得到30片葉子。從內(nèi)到外，每3片形態(tài)相似、大小相近的葉子為一葉輪，共得到10葉輪葉。

從每輪葉片中選取一片葉子，命名為L1-L10，選擇SAM、L1、L2、L3、L5、L7和L9進行轉錄組分析。對于RNA-seq，L2被分為兩部分，葉柄(L2R2）和葉片(L2R1），對于L3、L5、L7和L9，則分為五個區(qū)域，包括頂部(R1）、外緣(R2）、葉片的中部區(qū)域(R3）、葉柄的頂部(R4）和中部(R5）區(qū)域進行采樣。對來自兩個生物學重復（兩個葉頭）共計48個樣品用Illumina平臺進行轉錄組測序。

圖1. 跨越11個葉子層的葉子的代表性圖片

研究結果

1、轉錄組測序

對48個樣本進行轉錄組測序，共產(chǎn)生7.43×108高質量cleanreads，皮爾遜相關系數(shù)為0.92-0.99，所有生物學重復都高度相關。將cleanread與大白菜參考基因組進行比對，計算基因表達量TPM值，共鑒定出27,876個基因。其中，75.08%的基因在所有樣品中都有表達。

主成分分析(PCA）顯示沿主成分(PC）1和2有明顯的分離。PC1根據(jù)與SAM的距離將葉片樣本分開，而PC2將葉片和葉柄組織分開。層次聚類分析將樣本分為五類，與葉子形態(tài)分化一致。SAM和L1的樣本形成內(nèi)葉1(IL1）最接近莖尖的組織。內(nèi)葉2的葉片（IL2B）和內(nèi)葉2的葉柄（IL2P）代表L2-L5的葉片和葉柄組織，而外葉（OLB）和外葉柄（OLP）代表L2-L5的葉片和葉柄組織外葉（L7和L9），與葉子形態(tài)分化一致。

圖2. 抽穗期不同葉層大白菜葉片的轉錄組分析

2、差異表達基因分析

作者在全基因組水平上鑒定了不同葉片中的差異表達基因（DEG），以探索葉片之間的多樣性和潛在功能。通過分析，共發(fā)現(xiàn)9,133DEG，k-means聚類將差異基因分為14個共表達簇(CEC1-CEC14），這些CEC與圖1中的5個聚類簇緊密相關。IL1中DEGs的高表達水平以CEC1和2為代表。CEC1在SAM中高度表達，并以與分生組織發(fā)育、組織發(fā)育和近軸/遠軸極性相關的基因為代表。CEC2在SAM和L1高表達，包含與細胞分裂、細胞增殖、細胞生長和生長素生物合成過程相關的基因。IL2B中DEG的高表達水平以CEC4-6為代表。CEC4、5和6均富集于有機酸代謝過程、淀粉代謝過程、質體組織和硫苷代謝、光合光反應等過程。IL2P中DEGs的高表達以CEC9為代表。CEC9富含植物細胞壁相關過程，包括壁組織或生物發(fā)生，以及果膠代謝過程。OLB中DEGs以CEC7和8為代表。CEC7在L7葉片中高表達，并以與蛋白質修飾過程、蛋白質磷酸化和蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性相關的基因為代表。這些結果反映L7具有明顯的信號轉導和基因調控特征。CEC8在L9葉片中高表達，含有一組與葉綠素分解代謝過程、細胞分解代謝過程、防御反應調節(jié)、果糖反應和脫落酸激活信號通路相關的基因。OLP中DEG的高表達水平以CEC11和12為代表。CEC11中的基因在L7-L9的葉柄中高度表達，在任何基因本體(GO）術語中均未富集。CEC12中的基因在L9的葉柄中高度表達。這些基因可能主要參與脫落酸激活的信號通路、茉莉酸（JA）代謝過程、JA反應、防御反應、生物刺激反應、水楊酸反應和外部刺激反應。這些結果表明，L9可能在保護多葉頭部免受外部損害方面發(fā)揮作用。

圖3.差異基因在不同葉子中的表達譜

3、葉片發(fā)育相關基因的表達揭示葉球形成中的關鍵過渡葉

作者鑒定了細胞增殖相關基因和細胞擴張相關基因。結果表明，大多數(shù)細胞增殖基因在IL1HLs中達到峰值，包括SAM和L1，但在IL2HLs和外HLs中迅速下調(圖3A），表明細胞增殖基因在不斷生長的內(nèi)葉的起始過程中發(fā)揮重要作用。與細胞增殖基因不同，大部分細胞擴張基因在IL2HLs和外HLs的葉片區(qū)域高表達，且表達模式更為多樣，分為4個簇(圖3A）。此外，大部分細胞擴張基因在IL2HLs和外層HLs之間表現(xiàn)出不同的表達模式，導致L7細胞分裂和細胞擴張調控的變化明顯高于IL2HLs和外層葉(圖3B）。

圖4. 細胞增殖和細胞擴增基因的表達模式

大白菜HLs的彎曲通常被認為是由葉片正軸和背軸之間的不對稱細胞生長引起的。通過分析ad-ab極性基因的表達模式，以探究ad-ab極性基因在頭葉曲率中的作用。結果表明，與內(nèi)部HL相比，大多數(shù)ad-ab極性基因在外部HL中顯示出顯著不同的表達模式。

圖5.?ad-ab極性基因的表達譜。

通過形態(tài)學觀察、PCA和聚類分析，以及與細胞分裂/擴張和ad-ab極性相關的基因表達，L7位于內(nèi)葉和外葉之間的邊界。作者通過主成分分析和聚類將L7分類為外葉組，最終確定L7是顯示三種模式的過渡狀態(tài)。此外，作者進一步分析了HLs中可溶性糖的積累和相關基因的表達特征，進一步證實L7是葉狀頭部發(fā)育的關鍵過渡葉。

4、加權基因共表達網(wǎng)絡分析

為確定導致過渡葉特殊狀態(tài)的形成過程，作者進行加權基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）。WGCNA共確定了17個模塊。其中，五個模塊（greenyellow、magenta、purple、turquoise和yellow）與過渡葉密切關聯(lián)。兩個模塊，greenyellow和magenta，與過渡葉特別相關，并包含許多編碼蛋白激酶的基因，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK）、鈣依賴性蛋白激酶(CDPK）和富含半胱氨酸的受體樣激酶。關鍵過渡葉片L7可能受到復雜信號相互作用的調節(jié)，不僅是光和其他外部刺激，也有內(nèi)部激素。

文章亮點

作者報道了大白菜抽穗期的轉錄組圖譜，利用24個空間解剖組織，分別代表大白菜內(nèi)外葉的不同區(qū)域。全基因組轉錄組分析清楚地將內(nèi)葉組織與外葉組織分離開來。通過對葉片發(fā)育和糖代謝關鍵基因的空間表達分析，確定了關鍵過渡葉，關鍵過渡葉是第一批內(nèi)彎的葉片。關鍵過渡葉的形成由一個復雜的信號網(wǎng)絡控制，不僅包括內(nèi)部激素和蛋白激酶，還包括外部光和其他刺激。這個發(fā)現(xiàn)為揭示抽穗性狀的遺傳控制提供了新的見解和豐富的資源。研究過程中作者利用生活中常見材料，結合轉錄組進行分析，思路簡單，設計巧妙，值得借鑒學習。

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2022年值得關注的7大技術榜單

2021年利用空間轉錄組測序技術發(fā)文章呈現(xiàn)井噴式增長，其中已正式發(fā)表文章有40余篇，而空間轉錄組學為特色的預印本bioRxiv搜索“空間轉錄組學（spatial transcriptomics）”一詞，獲得了500余條結果，其中80余條是在2021年提交的，可以說2021年是空間轉錄組測序技術應用好文發(fā)表突飛猛進的一年。

2016年-2021年空間轉錄組文章發(fā)表趨勢和影響因子分布

通過檢索空間轉錄組發(fā)表文章的數(shù)據(jù)分析來看，該技術在2021年中得到廣泛應用，并且文章影響因子主要集中在10~20分區(qū)間，其占比高達39%，其次在30分以上占比達到30%，由此可見空間轉錄組測序技術的應用極大提升了文章的質量和檔次。

不僅如此，2021年空間轉錄組測序技術還在物種上有了新的突破，不再局限于人和鼠常見的模式物種，已經(jīng)開始邁入哺乳動物（豬）、家禽類（雞）、植物類（擬南芥、云杉、楊樹）等新的物種領域，極大拓展其應用范圍。

物種空間轉錄組文獻發(fā)表統(tǒng)計

2021年空間轉錄組在不同組織部位上應用也取得一些新進展：比如骨組織一類就有不少文章發(fā)表，有頭蓋骨[PNAS，IF=11.2]、腰骨骼肌[NatureCommunications，IF=14.9]、肩部肌腱[AnnRheum Dis，IF=19.1 ]；生殖器官有子宮內(nèi)膜[Nat Genet，IF=27.6]、卵巢[NatureBiotechnology，IF=54.9]；泌尿系統(tǒng)：前列腺[Nature Communications，IF=14.9]、膀胱[NatureCommunications，IF=14.9]；腸道組織：胎兒腸道[Cell，IF=41.6]；脂肪組織：皮下腹部[CellMetabolism，IF=27.3]；腦組織：腦內(nèi)炎癥[[Ann Rheum Dis，IF=19.1 ]，IF=24.9]、等皮質和海馬[Cell，IF=41.6]、腦神經(jīng)系統(tǒng)[AnnuRev Neurosci，IF=12.4]、前額葉皮層[Nat Neurosci，IF=24.9]、海馬和前額葉皮質[NatureCommunications，IF=14.9]等都組織區(qū)域都有不錯的研究報道，甚至連取材最困難的皮膚樣本都發(fā)表重要研究成果：皮膚肉芽腫[Nature Immunology ，IF=25.6]，空間轉錄組逐漸在更多的組織類型上得到廣泛的應用，揭示更深層次空間維度生物學表型。

空間轉錄組不同組織應用發(fā)表文獻統(tǒng)計

基于上面數(shù)據(jù)我們不難看出來前期研究，腦組織空間基因表達探索最為廣泛，當然還有心臟組織、肝組織前列腺組織；植物主要集中在花序器官的研究，隨著各種組織探索和嘗試，基本上空間轉錄組已經(jīng)在各種組織中全面開火，不管從技術的前瞻性也好，還是從空間這個維度深度闡釋一些生物學現(xiàn)象，彌補了細胞空間位置信息的趨勢，空間多組學技術毫無疑問成為引領科學研究的風向標。

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2021年度空間轉錄組動植物四大應用方向：時空圖譜篇（發(fā)育）、腫瘤篇、疾病機制篇、生物進化篇

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大腦是一個具有精密組織結構的重要器官。對于大腦結構-功能的關系、發(fā)育過程中大腦皮層以及退行性神經(jīng)疾病領域的研究，空間轉錄組可以揭示更多的信息。單細胞和空間轉錄組結合可以將關注的細胞類型及亞型√確的錨定到空間位置上，解析不同功能區(qū)域與細胞類型及亞型的關聯(lián)性。

文獻一

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實驗材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進行scRNA-seq，共捕獲79944個星形膠質細胞。3個LPS和saline小鼠大腦組織切片進行空間轉錄組。

研究背景：星形膠質細胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉變。這種轉變是如何受到時間和性別的影響，它在單細胞水平上的異質性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結論：在本研究中作者使用細菌細胞壁內(nèi)毒素脂多糖研究小鼠皮質星形膠質細胞在急性炎癥刺激后的轉錄組變化。發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞的轉錄組變化發(fā)生在數(shù)小時內(nèi)，隨著時間的推移急劇變化。通過對約80000個星形膠質細胞進行單細胞測序，發(fā)現(xiàn)炎癥引起廣譜的反應，亞型星形膠質細胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉變，并具有明確的轉錄組特征。利用空間轉錄組學和原位雜交技術將炎癥誘導的反應性星形膠質細胞的關鍵亞狀態(tài)錨定大腦區(qū)域。總之，數(shù)據(jù)集為分析星形膠質細胞異質性提供了強大的資源，并將有助于理解局部受限反應性星形膠質細胞亞狀態(tài)的生物學重要性。

圖1 DLPFC組織空間轉錄組學

文獻二

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實驗材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進行scRNA-seq，共捕獲79944個星形膠質細胞。3個LPS和saline小鼠大腦組織切片進行空間轉錄組。

研究背景：星形膠質細胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉變。這種轉變是如何受到時間和性別的影響，它在單細胞水平上的異質性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結論：在本研究中作者使用細菌細胞壁內(nèi)毒素脂多糖研究小鼠皮質星形膠質細胞在急性炎癥刺激后的轉錄組變化。發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞的轉錄組變化發(fā)生在數(shù)小時內(nèi)，隨著時間的推移急劇變化。通過對約80000個星形膠質細胞進行單細胞測序，發(fā)現(xiàn)炎癥引起廣譜的反應，亞型星形膠質細胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉變，并具有明確的轉錄組特征。利用轉空間錄組學和原位雜交技術將炎癥誘導的反應性星形膠質細胞的關鍵亞狀態(tài)錨定大腦區(qū)域?？傊瑪?shù)據(jù)集為分析星形膠質細胞異質性提供了強大的資源，并將有助于理解局部受限反應性星形膠質細胞亞狀態(tài)的生物學重要性。

圖2 單細胞轉錄組鑒定星形細胞亞群及空間轉錄組細胞定位

文獻三

英文題目：Molecular atlas of the adult mouse brain

中文題目：成年小鼠腦分子圖片

期刊：Science advances

IF：13.116

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32637622

實驗材料：三只雄性小鼠（9周齡）的大腦

研究背景：在建立子區(qū)域及其邊界的參考圖以及確定神經(jīng)元類型及其連接性的多樣性方面，對成年大腦進行映射是探索定義動物行為多樣性的腦回路的結構與功能關系的核心。實驗神經(jīng)科學依賴于重復準確地記錄和操縱特定大腦區(qū)域中神經(jīng)元亞型活動的能力，因此，基因靶向方法已被證明在針對細胞類型的靶向中極為有價值。

研究結論：作者基于全腦范圍內(nèi)ST模式的無監(jiān)督分類建立了成年小鼠大腦的分子圖譜。這種方法是一個在全腦范圍內(nèi)映射離散空間域的無偏方法，并且還利用空間信息開發(fā)分子方法以研究神經(jīng)系統(tǒng)組織，引入了分子和空間代碼進化保守性的能力，以及它們與生理學和病理學的關系。另外作者簡化了大腦基因索引測試區(qū)域分類的能力，這些基因也足以將整個成年大腦映射到相關的子區(qū)域。這種方法從分子視角對全腦進行分類繪制圖譜，并比較物種間腦區(qū)域分布的保守分子標記，可作為關鍵點為治療腦部疾病提供新策略。

圖3 空間轉錄組繪制全腦分子圖譜

空間轉錄組在神經(jīng)學方向研究思路

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